Ученый Бакстер Стокман (Джанкарло Эспозито), чей талант давно соседствует с одержимостью, создает в подвале своего дома мутаген. Вещество способно превратить обычное животное в разумное прямоходящее существо. Во время опыта над мухой в лабораторию врываются солдаты, посланные эксцентричной начальницей Стокмана. Она хочет забрать разработку себе. В завязавшейся потасовке контейнер с мутагеном оказывается в канализации. Там в странную жижу попадают четыре маленькие черепашки и немолодой крыс Сплинтер (Джеки Чан).
Изменившись внешне и обретя человеческие черты, Сплинтер привязывается к черепашкам и становится им отцом. Он учит малышей всему, что знает сам: приемам из боевиков с тем самым Джеки Чаном, любви к пицце пепперони и правилу никогда не говорить слово «крысятничать». Но важнее всего другое: нельзя доверять людям с поверхности, которые могут оказаться опасными. Впрочем, его приемным детям хочется совсем иного. Они мечтают увидеть огромный мир, о котором знают лишь по редким ночным вылазкам.
Леонардо (Николас Канту), Рафаэль (Брэйд Нун), Микеланджело (Шэймон Браун мл.) и Донателло (Мика Эбби) тайком выбираются наверх и постепенно открывают для себя человеческие увлечения: кино, стендап, ролики на Youtube, кей-поп. С каждым разом поверхность кажется им все привлекательнее. Одна из таких прогулок приводит их к знакомству с решительной Эйприл О’Нил (Айо Эдебири), а затем к встрече с куда менее приятным Суперфлаем (Айс Кьюб).
Выясняется, что муха из лаборатории Бакстера не погибла. Она собрала вокруг себя других мутировавших изгоев и решила избавиться от людей, которых считает жестокими захватчиками. Черепашкам такой замысел явно не подходит. Лео, Рафу, Майки и Донни придется проверить, насколько хорошо они освоили ниндзюцу и уроки мудрого Сплинтера.